隔離技術(shù)旨在安全處理放射性物質(zhì)，確保操作人員的安全[1]。自20世紀(jì)80年代起，隔離技術(shù)的運(yùn)用范圍顯著擴(kuò)大。起初，無菌檢查隔離器在歐洲實(shí)驗(yàn)室中嶄露頭角，它通過營造穩(wěn)定的環(huán)境條件，有效防止微生物對測試樣本的污染，進(jìn)而降低了假陽性結(jié)果的出現(xiàn)率；隨后，無菌隔離系統(tǒng)逐漸滲透至食品、制藥等多個(gè)工業(yè)領(lǐng)域，并得到了廣泛應(yīng)用。
目前，國際上常用的隔離系統(tǒng)主要有限制進(jìn)出屏障系統(tǒng) (restricted access barrier system，RABS) 和無菌隔離器 (isolator) 等 。
相較而言，無菌隔離器的優(yōu)勢明顯，因其采用完全密閉的系統(tǒng)將生產(chǎn)空間與周圍環(huán)境和操作人員完全隔離，可保護(hù)產(chǎn)品免遭環(huán)境污染 ( 包括來自操作人員在過濾和密封時(shí)帶來的污染 )。此外，無菌隔離器配備的單獨(dú)高效過濾器、空氣處理系統(tǒng)和無菌隔離器集成氣化過氧化氫滅菌系統(tǒng)，可自動控制無菌隔離器中的生產(chǎn)環(huán)境條件。通過陰性分?jǐn)?shù)法或過度殺滅法證實(shí)滅菌隔離器可以使微生物數(shù)降至 10–6 ，而在傳統(tǒng)潔凈室內(nèi)，微生物數(shù)只能控制在 10–3 的水平 。
《中華人民共和國藥典》2020年版（ChP 2020）四部通則9206中，針對無菌檢查法提出了具體的要求，并配套制定了無菌檢查用隔離系統(tǒng)的驗(yàn)證及應(yīng)用指導(dǎo)原則，為無菌隔離器的驗(yàn)證工作提供了規(guī)范。這些指導(dǎo)原則的發(fā)布，激發(fā)了眾多驗(yàn)證技術(shù)研究的興起。在無菌產(chǎn)品的質(zhì)量研究中，已明確多個(gè)環(huán)節(jié)如生產(chǎn)區(qū)設(shè)計(jì)布局、生產(chǎn)設(shè)備環(huán)境、物料污染狀況、人員操作及衛(wèi)生等，均對最終產(chǎn)品質(zhì)量至關(guān)重要。然而，現(xiàn)有研究大多聚焦于設(shè)計(jì)布局與物料狀態(tài)，對人員操作因素的影響探討相對較少。
針對凍干制劑呈粉狀、易通過呼吸危害人體的特性，以及灌裝過程中可能因操作不當(dāng)導(dǎo)致的污染問題，對無菌隔離器內(nèi)的操作進(jìn)行了精細(xì)設(shè)計(jì)與嚴(yán)格驗(yàn)證。凍干制劑的微粒性質(zhì)使其具有潛在的健康風(fēng)險(xiǎn)，因此，我們特別規(guī)定：
(1) 操作人員在無菌隔離器內(nèi)的所有動作均須保持平穩(wěn)，避免幅度過大或速度過快；
(2) 手套的使用必須嚴(yán)格限制，不得接觸任何與工藝操作無關(guān)的表面。這些規(guī)定已明確納入車間的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程中。
為確保操作人員遵守上述規(guī)范，并驗(yàn)證其操作是否符合文件要求，遵循相關(guān)法規(guī)，定期開展無菌工藝模擬測試和氣流流型測試。在每次測試前，均確保無菌隔離器內(nèi)部清潔合格，并排除前次操作對驗(yàn)證結(jié)果的任何潛在影響。通過這些措施，致力于保障凍干制劑的生產(chǎn)安全與產(chǎn)品質(zhì)量。
要保證操作人員在無菌隔離器內(nèi)的操作規(guī)范性，需先對操作人員在無菌隔離器內(nèi)的操作內(nèi)容進(jìn)行嚴(yán)格設(shè)計(jì)。設(shè)計(jì)內(nèi)容應(yīng)包含操作人員在無菌隔離器內(nèi)日常生產(chǎn)時(shí)的操作，以及無菌隔離器內(nèi)設(shè)備出現(xiàn)異常時(shí)的操作，并確保所有干預(yù)操作均是實(shí)際生產(chǎn)中可能出現(xiàn)的，不進(jìn)行不合理干預(yù) 。
每批生產(chǎn)均會發(fā)生的、正常的、有計(jì)劃的生產(chǎn)工藝本身固有的干預(yù)操作匯總見表 1，包括無菌隔離器內(nèi)的環(huán)境監(jiān)測、過渡部位對接、在線稱重、取樣等。糾正性干預(yù)操作 ( 即在生產(chǎn)過程中進(jìn)行糾正或調(diào)整的操作 ) 匯總見表 2，包括無菌隔離器使用過程中可能發(fā)生的情況，如倒瓶、炸瓶、碎瓶、傳感器異常和針頭調(diào)節(jié)等。
氣流流型測試是指通過將無菌隔離器內(nèi)的氣流可視化，來驗(yàn)證設(shè)備運(yùn)行和人員操作是否會對流型產(chǎn)生影響。具體測試方法為有資質(zhì)的驗(yàn)證人員使用煙霧發(fā)生器進(jìn)行測試。在確保無菌隔離器處于關(guān)閉狀態(tài)后，驗(yàn)證人員將設(shè)置好的煙霧發(fā)生器連接發(fā)煙管、調(diào)整方向，對準(zhǔn)工作區(qū)域上方、均流膜下方 30 cm 處，啟動煙霧發(fā)生器，使煙霧進(jìn)入氣流并隨氣流流動。
傳統(tǒng)的潔凈室設(shè)計(jì)通常在關(guān)鍵區(qū)域采用單向流的方式，并且在靠近打開的無菌產(chǎn)品和容器的地方通常要求塵埃粒子符合 A 級潔凈度級別，以減少產(chǎn)品和人員污染。根據(jù)《醫(yī)藥工業(yè)潔凈廠房設(shè)計(jì)規(guī)范》和《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范 (2010 年修訂 )》附錄 1 無菌藥品的要求 [12—13]，A 級潔凈區(qū)采用單向流。然而，能否控制潔凈區(qū)內(nèi)的空氣潔凈度，氣流的影響較大。無菌隔離器內(nèi)為 A 級環(huán)境，能否在日常生產(chǎn)中一直維持其內(nèi)部的單向流對環(huán)境潔凈度、產(chǎn)品質(zhì)量有重要影響。該測試會使用攝像設(shè)備全程記錄生產(chǎn)過程中的煙霧流動方向。測試過程中，無菌隔離器內(nèi)設(shè)備處于正常生產(chǎn)狀態(tài)，人員在各個(gè)崗位進(jìn)行模擬干預(yù)操作，模擬操作方法見表 1、表 2。通過是否引起紊流或空氣停滯等異常狀態(tài)來驗(yàn)證人員在無菌隔離器內(nèi)的操作是否規(guī)范。
APS 是指使用大豆胰蛋白胨液體培養(yǎng)基來代替藥品進(jìn)行生產(chǎn)。因?yàn)樵诖蠖鄶?shù)情況下，微生物在培養(yǎng)基中的生長繁殖要遠(yuǎn)比在實(shí)際產(chǎn)品中容易，所以使用培養(yǎng)基進(jìn)行生產(chǎn)，其無菌風(fēng)險(xiǎn)遠(yuǎn)大于正常生產(chǎn)，不僅可用于評價(jià)生產(chǎn)工藝對產(chǎn)品無菌保證的有效性和穩(wěn)定性，還可用于驗(yàn)證人員的無菌操作能力。國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心在對企業(yè)的APS 檢查中也提出 ，相關(guān)企業(yè)在人員的培訓(xùn)與操作方面問題較大。因此，非常有必要對人員在無菌隔離器內(nèi)的操作進(jìn)行驗(yàn)證。
為保證該驗(yàn)證的普遍適用性，本研究對驗(yàn)證中的人員在無菌隔離器內(nèi)的操作行動進(jìn)行規(guī)范。在APS 驗(yàn)證中，人員需在無菌隔離器內(nèi)進(jìn)行“1.1”項(xiàng)下所述的干預(yù)操作，包含生產(chǎn)過程中可能涉及的所有操作，具體操作內(nèi)容如表 1、表 2 所示。
在整個(gè) APS 驗(yàn)證過程中，按 GMP 要求采用最差的灌裝條件，并且對無菌工藝模擬生產(chǎn)的培養(yǎng)基產(chǎn)品進(jìn)行促生長試驗(yàn)，保證操作人員的任何不規(guī)范操作均會反映在培養(yǎng)基產(chǎn)品上。同時(shí)，對無菌隔離器內(nèi)?A 級環(huán)境和無菌隔離器所在的 C 級背景環(huán)境按正常生產(chǎn)頻率進(jìn)行動態(tài)環(huán)境監(jiān)測，監(jiān)測項(xiàng)目為沉降菌、浮游菌、懸浮粒子和表面微生物。此外，及時(shí)記錄潔凈區(qū)之間的壓差、溫度和濕度，通過環(huán)境監(jiān)測結(jié)果和培養(yǎng)基產(chǎn)品的培養(yǎng)結(jié)果來驗(yàn)證人員在無菌隔離器內(nèi)的操作是否規(guī)范。
在無菌隔離器內(nèi)的設(shè)備處于正常生產(chǎn)狀態(tài)且人員在各個(gè)崗位上進(jìn)行模擬干預(yù)操作的條件下，由相關(guān)驗(yàn)證人員完成氣流流型測試。驗(yàn)證人員應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況，選擇無菌隔離器內(nèi)的流型測試點(diǎn)，確保人員在無菌隔離器內(nèi)的模擬干預(yù)操作均在煙霧氣流下方。氣流流型測試動作節(jié)選如圖所示，人員在無菌隔離器內(nèi)進(jìn)行操作時(shí)，無菌隔離器內(nèi)的單向流沒有發(fā)生改變，未產(chǎn)生紊流現(xiàn)象，且與靜態(tài)測試相比，氣流流型相同，則說明人員在無菌隔離器內(nèi)的操作規(guī)范，不會對無菌隔離器內(nèi)的環(huán)境產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響產(chǎn)品質(zhì)量。
無菌隔離器在生產(chǎn)前會進(jìn)行清潔、消毒、滅菌，以保證設(shè)備運(yùn)行前無微生物污染，不會對驗(yàn)證結(jié)果產(chǎn)生影響。
對無菌隔離器內(nèi)的固定設(shè)備和手套等采用異丙醇進(jìn)行噴霧和擦拭，以對其表面進(jìn)行清潔和消毒。無菌隔離器內(nèi)的灌裝壓塞機(jī)需進(jìn)行泄漏檢測，檢測合格后，進(jìn)行在線高溫濕熱滅菌 (121 ℃，30 min)。隨后，將設(shè)備運(yùn)行過程中所需的輔助器具 ( 如不銹鋼條和培養(yǎng)皿等物品 ) 經(jīng)預(yù)處理后放置于無菌隔離器中。按無菌隔離器驗(yàn)證的裝載示意圖定點(diǎn)放置后，對無菌隔離器進(jìn)行泄漏測試，測試合格后，采用經(jīng)第三方機(jī)構(gòu)通過對無菌隔離器內(nèi)的過氧化氫濃度以及生物指示劑的挑戰(zhàn)驗(yàn)證得出的滅菌運(yùn)行參數(shù)( 預(yù)處理 10 min、充氣 15 min、保壓 40 min、通風(fēng)120 min) 進(jìn)行滅菌，通風(fēng)至過氧化氫濃度降至 10–6以下，然后對過氧化氫滅菌曲線與崗位標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程模板曲線進(jìn)行審核，確保滅菌效果達(dá)到要求。過氧化氫滅菌曲線見如圖 3。
APS 過程在 C 級潔凈區(qū)背景下的無菌隔離器 A級潔凈區(qū)環(huán)境中進(jìn)行。操作人員按表 1 和表 2 所示模擬方法進(jìn)行干預(yù)操作，并記錄每項(xiàng)干預(yù)操作的次數(shù)和時(shí)間。整個(gè)過程通過攝像設(shè)備記錄，動作節(jié)選如圖4所示，操作人員通過手套箱操作時(shí)，動作干凈、移動緩慢且穩(wěn)健。
在 APS 全程中進(jìn)行沉降菌、浮游菌、懸浮粒子和表面微生物的監(jiān)測。沉降菌、浮游菌和懸浮粒子的采樣點(diǎn)確定與評估見表 3，監(jiān)測標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格遵守GMP 規(guī)定 ( 見表 4)。
表面微生物的監(jiān)測除設(shè)備表面、無菌隔離器手套表面外，還包括人員監(jiān)測 ( 如人員穿戴的潔凈服表面和人員佩戴的手套表面等 )，進(jìn)一步對人員在無菌隔離器內(nèi)的操作規(guī)范性進(jìn)行限制。監(jiān)測結(jié)果表明，整個(gè)模擬過程中微生物的污染水平未超過法規(guī)規(guī)定的限度，證明人員在無菌隔離器內(nèi)的操作不會對環(huán)境造成影響。除此之外，整個(gè)APS過程中，風(fēng)速、壓差和溫濕度等監(jiān)測結(jié)果均符合相關(guān)法規(guī)要求，監(jiān)測記錄曲線見圖 5。
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